【翻译】CTLA4抑制剂解除KEAP1/STK11-对PD-(L)1抑制剂的相关抗性
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07943-7以下翻译由AI提供
摘要对于晚期非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者，双重免疫检查点阻断 (ICB) CTLA4抑制剂和PD-1或PD-L1抑制剂 (以下称为PD-(L)1抑制剂) 与单独使用PD-(L)1抑制剂治疗相比，具有更高的抗肿瘤活性和免疫相关毒性。然而，目前没有经过验证的生物标志物来确定哪些患者将受益于双重ICB1,2。在这里，我们显示了NSCLC患者在STK11和/或KEAP1肿瘤抑制基因从PD-L1抑制剂durvalumab和CTLA4抑制剂tremelimumab的双重ICB中获得临床益处，但在随机III期POSEIDON试验中加入化疗时，单独使用durvalumab不能获得临床益处3。无偏见的遗传筛选确定了这两个肿瘤抑制基因的丢失是对PD-(L)1抑制的抗性的独立驱动因素，并显示Keap1是双重ICB功效的最强基因组预测因子-这一发现在几种小鼠模型中得到了证实Kras-驱动非小细胞肺癌。在小鼠模型和患者中，KEAP1和STK11改变与不利的肿瘤微环境有关，其特征是抑制性骨髓细胞占优势和CD8耗竭。+细胞毒性T细胞，但CD4相对较少+效应器子集。双ICB有效接合CD4+效应细胞和重编程的肿瘤骨髓细胞区室向诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)-表达与CD4一起的杀肿瘤表型+和CD8+T细胞-有助于抗肿瘤功效。这些数据支持使用具有双重ICB的化学免疫疗法来减轻患有以下疾病的NSCLC患者对PD-(L)1抑制的耐药性STK11和/或KEAP1改动。重点
使用抑制PD-1和PD-L1免疫检查点 (PD-(L)1i) 的抗体的免疫疗法已被证明可以延长晚期NSCLC患者的生存期，并且经常与铂类化疗 (CT) 联合使用，特别是对于肿瘤表达PD-L1低 (少于1% 的肿瘤细胞) 或中等的患者(1-49%) 水平4。一些证据表明，对PD-(L)1i的反应不仅取决于肿瘤PD-L1水平，还取决于肿瘤癌基因中基因组改变的存在，例如激活EGFR突变，以及肿瘤抑制基因 (tsg)。特别是，两种常见NSCLC tsg的改变与对PD-(L)1i缺乏反应性有关:STK11,它编码LKB1蛋白，作为肿瘤细胞代谢，生长和极性的主要调节剂; 和KEAP1,它编码一种衔接蛋白，该蛋白对NRF2的泛素化和蛋白酶体降解至关重要，因此是抗氧化剂和细胞保护反应的关键调节剂5,6,7,8,9,10,11。我们和其他人以前观察到，STK11和KEAP1可以促进免疫抑制性肿瘤微环境，并且在非鳞状NSCLC (nsNSCLC) 患者中，当作为单一疗法给予时，可能共同负责一半或更多的PD-(L)1i原发性耐药5,12,13,14,15,16,17。这些tsg中的失活体细胞突变通常共同发生，并在含有KRAS致癌突变。LKB1和KEAP1功能的丧失主要通过体细胞突变发生，但也可以通过基因组拷贝数丢失和非遗传机制发生。LKB1和KEAP1功能的丧失协同促进恶性肿瘤表型; 例如，LKB1的丧失会上调KEAP1-NRF2途径，从而驱动谷氨酰胺依赖性和对放疗和铁死亡的抗性18,19。到目前为止，临床上还没有疗法能有效克服与这些tsg失活相关的免疫抑制表型。当与PD-(L) 联合使用时，第二个免疫检查点CTLA4途径 (CTLA4i) 的抑制剂也改善了一些NSCLC患者的临床结果。1i (双重免疫检查点阻断或ICB)，有或没有化疗1,3,20。尽管PD-(L)1i的使用至少部分受肿瘤PD-L1水平的指导，目前没有常规使用的生物标志物用于选择与单独的PD-(L)1i相比更可能受益于双重ICB的患者。鉴于双重ICB比仅包含PD-(L)1i的方案引起更多的免疫相关不良事件，因此确定哪些患者可能受益于双重ICB尤为重要。虽然STK11和KEAP1突变与PD-(L)1i的有限益处相关，这些突变与PD-(L)1i与化疗组合的益处之间的关联尚未充分建立。为了解决这个问题，我们首先对871例接受标准化疗 (卡铂或顺铂加培美曲塞或CP) 的晚期nsNSCLC患者的多中心队列进行了回顾性分析；n = 432) 或CP与PD-1抑制剂派姆单抗 (PCP；n = 439) 作为护理标准治疗的一部分 (扩展数据表1)。在接受PCP治疗的患者中，患有肿瘤的患者STK11突变 (STK11MUT) 的无进展生存期 (PFS) 和总生存期 (OS) 明显短于STK11野生型 (STK11重量) 肿瘤 (PFS危险比 (HR) = 1.60，95% 置信区间 (CI): 1.24-2.07，P = 0.002通过对数秩检验，中位数PFS (mPFS) 分别为4.8和7.0个月; OS HR 1.55，95% CI: 1.18-2.05， P = 0.014; 中位OS (mOS) 分别为11.1个月和16.7个月 (图。1a和扩展数据图。1)。这种与更糟糕的结果相关联的发生，无论KRAS突变状态或肿瘤突变负荷 (TMB)，但取决于肿瘤PD-L1表达 (扩展数据图。1)。KEAP1突变 (KEAP1MUT) 与结局的负相关性更强，PFS明显缩短 (HR 2.07，95% CI: 1.35-3.17，mPFS 2.7与5.7个月KEAP1MUT和KEAP1重量分别，P 对数秩检验的 < 0.0001) 和OS (HR 2.24，95% CI: 1.42-3.54，mOS 7.6对16.6个月，p < 0.001) 较低的客观缓解率 (ORR; 14.3% 对43.0%，p <0.0001) (图。1a)。这个结果是独立的KRAS突变状态、TMB和肿瘤细胞PD-L1表达 (扩展数据图。1a)。两种改变的组合导致对PCP的ORR低于任何一种改变，对于缺乏任何一种改变的肿瘤，ORR为48.6%，对于任何一种改变的肿瘤，ORR为29.6% 或28.6%。STK11或KEAP1单独突变，两种突变的患者分别为7.1% (扩展数据图。1c)。值得注意的是，虽然两者STK11和KEAP1PCP化疗免疫治疗的改变与较差的临床结局相关 (图。1a和扩展数据图。1b,c) 和CP化疗 (扩展数据图。1d-f)，对它们的个体效应进行分析后发现，KEAP1改变在介导以铂类为基础的化疗不良结局中起主导作用，而STK11突变-在没有并发的情况下KEAP1改变-仅与CP对PFS和ORR的适度影响相关 (扩展数据图。1e,f)。化疗免疫疗法对患有以下疾病的患者的临床结局较差STK11-和/或KEAP1-在第二项回顾性研究以及KEYNOTE-189随机III期临床试验中也报告了突变型NSCLC，进一步支持了这些发现的有效性11,21。图1: PCP化疗免疫治疗患者的免疫基因组相关性和临床结局STK11-和/或KEAP1-突变晚期nsNSCLC。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41586-024-07943-7/MediaObjects/41586_2024_7943_Fig1_HTML.png
a,PFS，OS和ORR与培美曲塞，卡铂或顺铂和pembrolizumab (PCP) 的患者STK11MUT(n = 119) 与STK11重量(n = 320) (顶部) 或KEAP1MUT(n = 42) 与KEAP1重量(n = 103) (下) 晚期nsNSCLC。患者ORR (部分缓解 (PR)/完全缓解 (CR)) 的比较STK11MUT与STK11重量和KEAP1MUT与KEAP1重量肿瘤基于卡方检验。对数秩检验用于比较PFS和OS。使用Cox比例风险模型估计多变量 (MV) HRs (根据年龄，ECOG表现状态和脑转移的存在进行调整) 和95% ci。P ≤ 0.05被认为具有统计学意义。NS，不显著。b,个体和组合的患病率STK11和KEAP1高级LUAD的改变 (左；n = 8，592) 或KRAS-变异的LUAD (右；n = 3224) 来自基金会医学 (FMI) 数据库。c,TMB在单和双STK11MUT和/或KEAP1MUT和STK11重量/KEAP1重量FMI数据集中的LUAD。指示了每个亚组中中值TMB (表插入) 和具有每Mb 10个或更多突变或每Mb少于10个突变的TMB的肿瘤的分数 (条形图)。d,单、双PD-L1肿瘤比例评分 (TPS)STK11MUT和/或KEAP1MUT和STK11重量/KEAP1重量FMI数据集中的LUAD (n = 8836)。使用2 × 4列联表的卡方检验比较了四种肿瘤基因型中PD-L1-positive (tps ≥ 1%) 和阴性 (tps < 1%) 肿瘤的分布。e,PD-L1-negative (tps < 1%，灰色圆圈) 与PD-L1-positive (tps ≥ 1%，红色圆圈) LUAD中或高TMB (TMBI/H；每Mb六个或更多突变；n = 4672)。单个圆圈的大小与相应改变的发生率成正比。使用双侧Fisher精确检验进行统计比较，并在错误发现率 (FDR) 调整后建立统计显着性P ≤ 0.05.
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免疫相关因素STK11 MUT和KEAP1 MUT非小细胞肺癌为了进一步研究可能导致耐药性的机制STK11MUT和KEAP1MUT对于PD-(L)1i的肿瘤，我们调查了8，592例具有这些和其他改变的肺腺癌 (LUAD) 患者的免疫和基因组谱 (基础医学 (FMI) 队列)。STK11和/或KEAP1在整体LUAD的25.2% 和32.4% 中观察到突变，并且KRAS-分别为突变的LUAD种群 (图。1b)。对于其他对PD-(L)1i反应不良的非小细胞肺癌亚群，如含有EGFR突变或ALK融合，较低的TMB和/或较低的PD-L1水平被认为有助于其免疫冷表型22,23,24。相比之下，高TMB与对PD-(L)1i和双重ICB的反应性改善有关25,26。因此，我们研究了PD-(i) ii反应的缺乏是否可能是由于低TMB和/或低水平的PD-L1。值得注意的是，我们观察到，与两个基因均为野生型的肿瘤 (中位数TMB每Mb 5.22突变) 相比，STK11或KEAP1TMB较高。这是特别值得注意的KEAP1MUT肿瘤 (中位TMB 13.05突变/Mb) (图。1c)，特别是在没有并发的情况下KRAS突变 (扩展数据表2)。因此，较低的TMB似乎并不能解释STK11MUT和KEAP1MUT非小细胞肺癌肿瘤免疫治疗。接下来，我们研究了这些改变与PD-L1水平之间的关联。STK11MUT肿瘤，在不存在或存在KEAP1与两个基因的野生型肿瘤相比，突变的PD-L1水平显着降低，与先前的观察结果一致5,9,11,12,13,27,28鉴于KEAP1MUT肿瘤 (在没有STK11突变) 没有较低的PD-L1水平 (图。1d)。这表明PD-L1水平较低，表明缺乏免疫参与，导致PD-(L)1i反应的缺乏STK11MUT-但不是在KEAP1MUT-非小细胞肺癌，那STK11和KEAP1具有重叠以及不同的机制，通过它们促进免疫抑制肿瘤微环境。接下来，我们研究了其他基因组改变是否也与较低的PD-L1水平相关，以及这些改变与STK11。考虑到低TMB和低PD-L1水平之间的可能关联29,我们将分析限于具有中等或高TMB的肿瘤 (TMBI/H,每Mb六个或更多突变；n = 4672)。我们观察到STK11是PD-L1-negative肿瘤中最显著富集的基因 (图。1e)。值得注意的是，KEAP1MUT无并发的LUAD肿瘤STK11变更 (KEAP1MUTSTK11重量) 在PD-L1-negative肿瘤中没有富集，并且表现出与两个基因野生型的LUAD肿瘤相似的PD-L1表达水平 (STK11重量KEAP1重量)。
双ICB输入STK11 MUT和KEAP1 MUTnsNSCLC鉴于两者之间的相关性STK11和KEAP1转移性nsNSCLC患者的突变和不良结果，以及先前的证据表明，这些改变促进PD-(L)1i耐药和免疫学 “冷” TME，我们假设在这种情况下，双重ICB比PD-(L)1i单药治疗提供了更大的益处，正如在NSCLC和其他肿瘤类型中提出的那样30。为了进一步研究这一点，我们评估了在POSEIDON研究中接受治疗的患者，这是一项针对1，013例转移性NSCLC患者的随机III期研究，比较了单独的标准化疗 (CT) 和CT联合PD-L1i durvalumab (DCT) 或durvalumab和CTLA4抑制剂tremelimumab (TDCT) 的组合 (扩展数据图。11)。这项研究的主要临床结果以前曾报道过3。共有637例患者具有非鳞状组织学，其中612例 (96%) 可评估突变；KRAS,STK11和KEAP1突变分别存在于该人群的30% 、14% 和6% 中 (扩展数据图。11)。患病率的差异STK11和KEAP1来自不同种族背景的患者之间的突变，与FMI和回顾性真实世界队列相比，不同的测定平台和未知意义变体的可变纳入标准可能解释了所报告的个体改变患病率中观察到的微小变化。这些亚组的基线临床和分子特征显示在扩展数据图中。11。与之前对派姆单抗加化疗的观察结果一致，STK11和KEAP1与野生型肿瘤患者相比，DCT组中突变与更差的结果相关。OS的HR为1.83 (95% CI: 1.22-2.74)STK11MUT与STK11重量肿瘤; 1.44 (95% CI: 0.80-2.59)KEAP1MUT与KEAP1重量肿瘤; 和1.70 (95% CI: 1.17-2.48)，其中任一基因突变的那些与两个基因均为野生型的那些。PFS也有类似的效果 (扩展数据图。2a)。接下来，我们研究了DCT与单独CT相比的相对益处。在患者STK11和/或KEAP1突变 (称为STK11/KEAP1亚组)，DCT与CT相比，durvalumab联合化疗在延长PFS方面没有益处 (HR 1.00，95% CI: 0.57-1.77); 值得注意的是，将durvalumab加入化疗可延长无这些改变的患者的PFS (STK11/KEAP1WT，HR 0.74，95% CI: 0.57-0.96) (图。2a)。OS也观察到类似的趋势 (图。2b)。这表明患者STK11和/或KEAP1在化疗中加入durvalumab，如果有的话，突变几乎没有获益，而且DCT的获益主要局限于缺乏任一基因突变的患者.图2: III期波塞冬临床试验中分子定义的患者亚组的临床结果。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41586-024-07943-7/MediaObjects/41586_2024_7943_Fig2_HTML.png
a,b,根据RECIST v.1.1的盲独立中央审查 (BICR) 对PFS的kaplan-meier估计 (a) 和操作系统 (b) 与tremelimumab，durvalumab和铂类化疗 (TDCT，浅蓝色曲线)，durvalumab加铂类化疗 (DCT，深蓝色曲线) 或铂类双化疗 (CT，红色曲线) 患者 (i)STK11MUT和/或KEAP1MUT(左) 和 (二)STK11重量和KEAP1重量(右) 转移性nsNSCLC。还显示了每个治疗组中具有里程碑意义的12个月PFS率以及24个月和36个月OS率 (虚线)。NE，不可评估。c,kaplan-meier估计TDCT、DCT或CT患者的OSKRASMUT(左) 和KRAS重量(右) 转移性nsNSCLC。PFS和ORR分析基于2019年7月24日的数据截止日期。OS分析基于2021年3月12日的数据截止日期。使用非分层Cox比例风险模型估计hr和95% ci。
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然后，我们研究了在DCT中添加tremelimumab是否可以减轻与STK11/KEAP1通过将TDCT臂与DCT和CT臂进行比较来分组。对于STK11/KEAP1亚组，TDCT组的ORR (42.9%) 高于DCT (30.2%) 或CT (28%) 组 (扩展数据图。2b)。对反应持续时间 (DoR) 的分析，使用蜘蛛图 (扩展数据图。2b)，支持以下发现: 添加双重ICB不仅增加了STK11/KEAP1-对治疗有反应的突变肿瘤，但增加了中位DoR，CT组仅为3.3个月，DCT组为12.7个月，TDCT组为13.6个月。在STK11/KEAP1与CT组相比，TDCT改善了PFS和OS (HR 0.52 (95% CI: 0.28-0.95) 和0.50 (95% CI: 0.29-0.87))，独立于KRAS突变状态、肿瘤细胞PD-L1表达或TMB (图。2a,b和扩展数据图。2c)。为了确定增加CTLA4阻断的临床益处，我们对TDCT和DCT组的生存率进行了比较分析。在STK11/KEAP1亚组，TDCT组的中位OS增加了一倍以上 (15.8个月对7.3个月，HR 0.64，95% CI: 0.40-1.04; 图。2b)，而在任一基因缺乏突变的组中，添加tremelimumab几乎没有益处 (17.2个月对17.1个月，HR 0.90，95% CI: 0.69-1.17)。OS在TDCT臂中是有利的，无论KRAS突变状态或肿瘤细胞PD-L1表达 (扩展数据图。2c)。PFS也观察到类似的趋势 (图。2a)。在以下情况下也观察到一致的结果STK11和KEAP1改变是单独评估的，尽管这项分析受到患者数量有限的限制KEAP1MUT肿瘤 (扩展数据图。3)。KRAS突变也与tremelimumab益处相关，部分原因是更高的频率STK11和KEAP1这一亚组的突变 (图。2c和扩展数据图。4)。值得注意的是，PD-1抑制剂nivolumab和CTLA4抑制剂ipilimumab联合铂类化疗与单纯化疗相比，有改善预后的趋势。STK11-和/或KEAP1-在CheckMate 9LA III期随机临床试验中也观察到了突变的NSCLC31。这些数据支持以下假设: CTLA4抑制可以减轻在患有以下疾病的患者中观察到的对化疗加PD-(L)1i的抗性STK11和/或KEAP1突变，并表明这组患者从CTLA4抑制中获得的益处大于缺乏任一改变的患者。
双重ICB疗效的机制鉴于观察到的双重ICB化疗免疫治疗的临床疗效，但PD-(L)1iSTK11-和/或KEAP1-突变的NSCLC，我们接下来测试是否失活Stk11,Keap1或在NSCLC中频繁突变的其他tsg直接影响使用NSCLC的免疫活性小鼠模型对PD-(L)1i或双重ICB的敏感性。我们首先进行了集中于TSG的体内CRISPR-Cas9遗传筛选，旨在鉴定免疫逃避和PD-1i抵抗的候选癌细胞内在介质。C57BL/6小鼠植入文库转导的Lewis肺癌3LL细胞，并用anti-PD-1或同种型对照IgG处理 (图。3a)。在这个不偏不倚的屏幕上，Stk11和Keap1作为三个最显著富集的tsg中的两个出现 (图。3b)。多个独特的单向导rna (sgrna) 靶向的逐步富集Stk11或Keap1在 (i) 裸鼠，(ii) 用IgG同种型对照抗体治疗的同系，免疫活性的C57BL/6小鼠和 (iii) 中生长的皮下肿瘤中用anti-PD-1处理的C57BL/6小鼠反映了增强的适应性Stk11-或Keap1-免疫压力不断增加的缺陷细胞 (图。3c)。因此，停用Stk11和Keap1在NSCLC模型中构成免疫逃避和对PD-(L)1轴阻断的直接，独立介质-与以前的报告一致12,13,我们的回顾性非小细胞肺癌队列 (图。1) 和波塞冬研究的临床数据 (图。2)。图3: anti-PD-1单一疗法和双重anti-PD-1/anti-CTLA4疗法在免疫能力模型中的疗效STK11-和/或KEAP1-缺陷性非小细胞肺癌。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41586-024-07943-7/MediaObjects/41586_2024_7943_Fig3_HTML.png
a,左，体内以TSG为重点的CRISPR-Cas9筛选平台，用于鉴定PD-1抑制剂抗性的驱动因素。对，未经治疗的裸鼠肿瘤生长逐渐减少 (n = 18) 到用抗IgG治疗的C57BL/6小鼠 (n = 18) 给C57BL/6小鼠用anti-PD-1 (n = 20) 反映了增加的抗肿瘤免疫力。数据为平均值 ± s.e.m。b,用anti-PD-1 (5 mg/kg；n = 20; 10 mg per kg;n = 25; 总计n = 45) 与抗IgG同种型对照 (n = 18)。c,相对对数的箱形图2-针对sgrna靶向的转化折叠变化Stk11(左) 或Keap1(右) 跨治疗组 (裸体，n = 18; IgG,n = 20; anti-PD-1 5 mg/kg，n = 20)。单个sgrna由彩色圆圈表示 (每个基因10个sgrna)。显示了中位数 (中心线) 、四分位数范围 (箱形图边缘) 和数据范围 (胡须)。d,pgx-tuba-seq实验策略，用于体内多重定量评估TSG耗竭对自体，基因工程的免疫治疗反应的影响KrasG12D-驱动LUAD模型 (参见方法)。IFU，传染病单位。e相对肿瘤数 (RTN) 评分反映了与anti-PD-1单一疗法相比，对双重anti-PD-1/anti-CTLA4阻断的敏感性差异。重要效果以颜色突出显示 (n = 16-19只小鼠/组)。f,对几个国家的双ICB的敏感性STK11和/或KEAP1-缺乏同系模型KrasG12D(KK,KLK) 和KrasG12C(KL2,KL5) 突变型非小细胞肺癌 (n = 8-10只小鼠/组)。在任何治疗组中的第一只小鼠达到终点的时间点进行肿瘤体积 (TV) 的比较 (肿瘤体积 ≥ 1，500 mm3)，并基于曼-惠特尼U测试。数据为平均值 ± s.d。肿瘤体积时间 (TTV) ≥ 1，200 mm3被用作生存的替代品。治疗组之间TTV的比较基于对数秩检验。显示了统计意义 (*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。源数据
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接下来，我们研究了基因工程自体肺癌模型中，与PD-(L)1i相比，特定的基因组改变是否可以促进对双重ICB的差异敏感性。具体来说，我们使用肿瘤条形码结合高通量条形码测序 (Tuba-seq32) 和多重体细胞CRISPR-Cas9基因组编辑，以定量评估灭活22个tsg相对于anti-PD-1单一疗法对双重ICB疗效的影响32(图。3d,e和扩展数据图。5a-e)。用条形码编码的lenti-sgrna/Cre载体池启动肿瘤后12周，KrasLSL-G12D/+H11LSL-Cas9小鼠 (n = 16-19每组) 被随机分配到治疗组 (i) anti-PD-1和anti-CTLA4 (anti-PD-1/anti-CTLA4); (ii) anti-PD-1和同种型对照 (anti-PD-1)；(iii) anti-CTLA4和同种型对照 (anti-CTLA4); 或 (iv) 同种型对照 (扩展数据。5a)。治疗三周后，从大量荷瘤肺中提取基因组DNA，用于tuba-seq文库生成和分析 (图。3d)。几个tsg的失活-包括Stk11在较小的程度上，Keap1-如前所述，在没有治疗的情况下促进体内肿瘤生长33,34,35(扩展数据图。5c)。值得注意的是，灭活Keap1与anti-PD-1单药治疗相比，对双重ICB的敏感性显著增强 (图。3e和扩展数据图。5d,e)。为了进一步验证这些发现，我们使用了几种由KrasG12C(最普遍的KRAS非小细胞肺癌中的突变等位基因) 或KrasG12D和同时失活的Stk11和/或Keap1。我们推测，由于两者之间的部分共享生物学Keap1和Stk11丢失，包括NRF2-driven转录程序的上调18,36,双重ICB可能代表一种适用于两种肿瘤基因型的有效治疗策略，如POSEIDON的亚组分析所支持。在几种具有免疫能力的小鼠模型中KrasG12C或KrasG12D-驱动NSCLCKeap1和/或Stk11失活对anti-PD-1治疗具有不同程度的抵抗力，联合anti-PD-1/anti-CTLA4可显着抑制皮下同种异体移植肿瘤的生长并延长生存期 (定义为达到肿瘤体积至少1，200？Mm的时间3,或死亡或病情丧失)，与同种型IgG对照相比 (图。3f)。Stk11-缺陷模型包括基因工程小鼠KG12CL2(KL2) 和KG12CL5(KL5) 肿瘤衍生的LUAD模型以及LKR13的等基因衍生物KrasG12D-驱动具有CRISPR-Cas9-mediated失活的LUAD细胞系Stk11和Keap1(KLK,克隆18)。虽然Keap1-缺陷模型也显示出对PD-1i单药治疗的相对抵抗力，这种效果更加多变，范围从完全到部分不敏感; 相比之下，KK(KrasG12D-突变体和Keap1-不足) 和KLKLKR13模型与anti-PD-1联合使用以及作为单一疗法对anti-CTLA4-both表现出明显的敏感性-这导致了一部分治疗小鼠的长期肿瘤消退 (图。3f)。当临床前试验扩大到纳入LKR13同种异体移植队列 (源自不同的单细胞衍生的克隆17) 时，获得了类似的结果。单独或与anti-PD-1或anti-PD-1/anti-CTLA4联合使用铂双重化疗，以更好地模拟波塞冬临床试验的分支 (扩展数据图5f,g)。值得注意的是，尽管anti-PD-1治疗 (有或没有同时进行基于铂的双重化疗) 和双重ICB (有或没有化疗) 都减少了体内肿瘤的生长K同种异体移植模型中，只有双重ICB (有或没有化疗) 在等基因KLK模型 (扩展数据图。5g)。此外，在抗肿瘤免疫的振兴KLK用PD-1/CTLA4共抑制选择性地实现同种异体移植模型，并且在同时抑制PD-1和TIM-3或LAG-3时未观察到 (扩展数据图。5小时)。总之，这些发现提供了证据，包括抗PD-(L)1和anti-CTLA4的双重ICB可以减轻PD-1i治疗的原发性耐药Stk11-不足，更明显的是，在Keap1-缺乏NSCLC模型。询问对双重ICB敏感性增加的机制基础STK11和/或KEAP1-突变的NSCLC，我们接下来调查的免疫表型Stk11和/或Keap1-使用基于荧光激活细胞分选 (FACS) 的免疫谱分析的缺陷小鼠肿瘤和PD-(L)1和/或CTLA4途径的阻断作用。两者的肿瘤免疫微环境 (时间)Stk11-和Keap1-治疗前缺乏肿瘤的特征是骨髓细胞亚群的积累和CD8的缺乏+细胞毒性T细胞，导致CD11b显着增加+/CD8+比率 (图。4a和扩展数据图。6a-c)，与他们先前报道的免疫抑制表型一致5,12,13,37。值得注意的是，Stk11失活主要增强了多形核中性粒细胞区室，并引发了中性粒细胞/CD8的显着增加+比率，而损失Keap1培养了丰富的肿瘤相关巨噬细胞和单核细胞以及中性粒细胞的时间 (图。4a和扩展数据图。6a)。单细胞RNA测序 (scrna-seq) 分析进一步支持了这些结果，该分析揭示了从Stk11-和/或Keap1-缺陷肿瘤 (扩展数据图。6d-i)。骨髓和淋巴亚群相对丰度的这种不平衡STK11MUT和/或KEAP1MUT肿瘤在三个独立的手术切除的nsNSCLC队列中重述，并使用LKB1丢失或NRF2转录激活的功能特征进一步验证38(扩展数据图。7a-c)。尽管与野生型对照相比，T细胞占总免疫浸润的比例大幅减少，更详细的分析揭示了效应T细胞的不同群体中的非均匀变化。Keap1-缺乏肿瘤 (K7和K8) 有减少CD8的趋势+细胞毒性T细胞，但保留或增加CD4+T细胞亚群，包括T辅助细胞1 (TH1) 细胞 (t-bet+CD4+)，导致T显著增加H1/CD8+所有测试模型的比率 (图。4a和扩展数据图。6a-c)。Stk11-缺陷型肿瘤的CD8消耗严重+细胞 (图。4a和扩展数据图。6c) 和CD4的相对保留+T细胞，也导致T细胞增加H1/CD8+比率 (图。4a和扩展数据图。6a,c)。我们对手术切除的nsNSCLC的非小细胞肺癌 (ICON) 数据集的免疫基因组学分析揭示了广泛一致的模式:STK11MUTKEAP1MUT或WT和STK11重量KEAP1MUTnsNSCLC在T中表现出相对富集H1个CD4+T细胞 (扩展数据图。7d)。在癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集中观察到类似的发现 (扩展数据图。7e)。图4: 先天免疫细胞和CD4+效应子是双重anti-PD-1/anti-CTLA4疗效的关键介质Stk11-和/或Keap1-缺乏模型KRAS-突变型非小细胞肺癌。https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41586-024-07943-7/MediaObjects/41586_2024_7943_Fig4_HTML.png
a,基于FACS的免疫细胞亚群计数Keap1-不足 (K7，K8)，Stk11-缺陷 (L6，L9) 或等基因Keap1和Stk11-精通LKR10 (对照，Con) 同种异体移植肿瘤揭示了髓样细胞富集和CD8+T细胞耗尽的抑制时间与T的相对保留H1个CD4+细胞。数据为平均值 ± s.d。(n = 7-8只小鼠/组)。TAMs，肿瘤相关巨噬细胞。b,基于FACS的评估单个和双重ICB诱导的微环境中不同T细胞 (左图) 和骨髓细胞 (右图) 子集的丰度变化Stk11-和Keap1-不足KLK模型。数据平均为 ± s.d. (n = 7-8只小鼠/组)。EffM，效应记忆细胞。cCD4的影响+或CD8+耗竭对体内生长动力学的影响KL5和KK在没有治疗或双重anti-PD-1/anti-CTLA4治疗的情况下的模型 (n = 7-8只小鼠/组)。在任何治疗组中的第一只小鼠达到肿瘤体积的时间点进行肿瘤体积的比较 ≥ 1，500 mm3。d,双重PD-1/CTLA4 ICB的抗肿瘤活性KL5模型依赖于先天免疫细胞 (n = 7-10只小鼠/组)。示出了所指示的治疗臂的肿瘤体积。e,iNOS抑制削弱了双重ICB在KLK型号 (n = 7-8只小鼠/组)。在任何治疗组中的第一只小鼠达到肿瘤体积的时间点进行肿瘤体积的比较 ≥ 1，200 mm3。还示出了anti-PD-1 + anti-CTLA4 (红色) 和l-nil + anti-PD-1 + anti-CTLA4 (紫色) 治疗组中的个体肿瘤生长轨迹。曼-惠特尼U测试用于所有成对的统计比较。数据为平均值 ± s.d。显示了统计意义 (*P ≤ 0.05,** P ≤ 0.01,*** P ≤ 0.001)。源数据
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为了进一步调查的敏感性Keap1-和Stk11-突变肿瘤对CTLA4阻断和双重ICB，我们治疗了具有同系基因的免疫能力小鼠克拉斯-突变型侧翼肿瘤与失活Keap1(KK; LKR13KrasG12DK),Stk11(KL5;KG12CL5) 或两者 (KLK; LKR13KrasG12D,克隆18)，具有anti-PD-1，anti-CTLA4，双重ICB或IgG同种型对照。治疗开始两周后收集肿瘤，随后通过基于FACS的分析评估不同髓样和T细胞群的调节 (图。4b和扩展数据图。8a,b)。双重ICB导致CD4的强劲增加+子集，包括TH1个T细胞 (t-bet+CD4+) 和效应器记忆CD4+T细胞 (CD4+CD44+CD62L−)，占CD45的百分比+所有测试模型的人口 (图。4b和扩展数据图。8a)。这一发现与以前关于CD4的报道一致。+响应CTLA4通路阻断的T细胞表型扩增39,40。值得注意的是，ICOS的频率增加+CD4+肿瘤组织中的细胞响应于PD-1/CTLA4联合阻断 (这在我们的模型中也很明显; 扩展数据图。8b) 以前与临床研究中疗效的提高以及细胞因子产生的增加有关，这可能会促进CD8的募集和激活+T细胞40,41。监管T (T注册) 在我们的研究中，细胞没有因双重ICB而耗尽，在所有情况下，TH1/T注册比率大幅提高 (图。4b和扩展数据图。8a,b)。类似的发现在另一个观察Stk11-缺陷模型 (KL2;KG12CL2)(扩展数据图。8c)。双重治疗对CD8的影响+尽管双重ICB通常观察到适度的增加 (扩展数据图。8b,c)。值得注意的是，双重ICB极大地重塑了骨髓细胞区室，并引发了iNOS的显着诱导+抗原呈递细胞、单核细胞、中性粒细胞和MHCII+几个测试模型中的肿瘤相关巨噬细胞 (图。4b和扩展数据图。8a-c)。在不同的单细胞衍生的LKR13模型中获得了可比的结果 (KLK克隆17) 对双重ICB有反应，有或没有化疗 (扩展数据图。9a,b)。与他们对PD-1抑制的顽固相一致 (作为单一疗法或与铂双重化疗联合)，KLK同种异体移植肿瘤显示CD4增加+TH1细胞和仅在包括同时CTLA4抑制的治疗组中积累的表达iNOS的肿瘤杀伤髓样细胞亚群 (扩展数据图。9a,b)。这些数据表明，先天免疫细胞，包括一个或多个骨髓细胞亚群，以及CD4+-和潜在的CD8+-T细胞效应子亚群可能是这些肿瘤对双重ICB反应的重要贡献者。为了直接检验这一假设，我们最初特异性地耗尽了CD4 + 或CD8+使用anti-CD4或anti-CD8抗体的T细胞，并测试双重ICB对上述生长的影响KK和KL5免疫能力小鼠的同基因模型。选择性清除CD4 + 或CD8+通过脾细胞和肿瘤的FACS分析证实了T细胞 (扩展数据图。10a)。的增长KL5没有ICB的肿瘤不受CD4的影响+或CD8+T细胞耗竭，与基线时的惰性免疫表型一致 (图。4c)。CD8 + 耗竭 (但不是CD4+) T细胞促进了肿瘤的加速生长KK模型，表明在这种肿瘤基因型中更活跃的免疫监视，而CD4的耗竭+T细胞具有较小的影响。在两种模型中，与同种型对照治疗的小鼠相比，双重ICB显著抑制了体内肿瘤的生长 (图。4c)。CD8耗竭+在两种模型中，T细胞使联合疗法的抗肿瘤活性无效。至关重要的是，双重ICB的疗效也严格依赖于CD4+T细胞在Keap1-不足KK模型，而Stk11-不足KL5肿瘤表现出对CD4的部分依赖性+T细胞。尽管效应物和抑制物同时耗竭 (即，T注册) CD4+T细胞亚群 (图。4c)。接下来，我们检查了髓样细胞亚群对双重ICB的抗肿瘤活性的潜在贡献。在双重ICB之前和期间使用anti-Ly6G，anti-CCL2或其组合 (anti-Ly6G anti-CCL2) 治疗完全消除了anti-PD-1/anti-CTLA4抑制联合KL5模型 (图。4d)，而在KLK模型 (扩展数据图。10b)。值得注意的是，高度特异性抑制剂l-nil对iNOS的化学抑制作用 (N6-(1-亚氨基乙基)-L-赖氨酸) 在KLK模型部分废除了对双重ICB的肿瘤根除 (图。4e)。对CD4的依赖+T细胞，骨髓细胞和iNOS对这些肿瘤的免疫介导的杀伤是值得注意的，根据以前的报告，发现CD4+T细胞诱导的炎性细胞死亡可能在根除逃避直接CD8的免疫惰性，MHC I类缺陷黑色素瘤肿瘤中起关键作用+瞄准目标42。在该研究中，观察到相对稀疏的CD4+TH1存在于肿瘤边缘的细胞将骨髓细胞重编程为更具吞噬性和肿瘤表型，并引发远端炎性细胞死亡。据报道，嗜中性粒细胞介导的，iNOS依赖性的对双重ICB反应的肿瘤细胞根除对于抗原异质性肿瘤的清除至关重要。43,44；因此，这种依赖性可能与STK11MUT以抗原加工和/或呈递缺陷为特征的肿瘤16。总之，这项研究提供了证据STK11和KEAP1在转移性NSCLC患者中，突变与PD-(L)1抑制剂联合化疗相对缺乏益处有关，并且如在POSEIDON研究的TDCT臂中观察到的，可以通过添加CTLA4阻断来减轻这种抗性。在几种具有免疫能力的小鼠模型中进行无偏见的遗传筛选，证实了Stk11和Keap1促进对PD-(L)1抑制剂的抗性并赋予对双重ICB的选择性敏感性。从机理上讲，PD-(L)1和CTLA4的联合抑制利用了至少两个抑制作用的基本特征。STK11MUT和/或KEAP1MUTNSCLC时间 :( a) 某些anti-CTLA4-responsive CD4的相对保留+T细胞亚群，包括TH1个T细胞 (t-bet+CD4+); 和 (b) 一种富含髓样细胞的肿瘤生态系统，可以响应双重ICB对表达iNOS的杀肿瘤表型进行重编程。免疫环境中的这种明显的不平衡STK11MUT和/或KEAP1MUTNSCLC可以至少部分地支持双重ICB与化疗联合用于这种难以治疗的患者群体的临床效用。表面上，循环中性粒细胞的募集也可能有助于双重ICB的抗肿瘤活性，值得注意的是，患者STK11MUT以前曾报道NSCLC具有较高的循环中性粒细胞与淋巴细胞比率45。此外，尽管我们的实验并非旨在解决直接fc γ r介导的先天免疫重塑的可能贡献，但这可能至少部分影响临床环境中的抗肿瘤功效。46,47,48。为了支持这种可能性，对来自单个骨髓细胞转录组的分析KK或KLK同种异体移植肿瘤显示表达增加Fcgr4(扩展数据图。6h,i)。双重ICB的几种可能的进一步影响，包括从头CD8+淋巴器官中的T细胞引发和T细胞受体库的扩增可能不是肿瘤基因型特异性的，而是可能广泛适用于不同癌症类型的免疫学 “冷” 肿瘤。这种免疫表型和CTLA4抑制剂反应性的其他下游介质是活跃研究的领域。先前的研究强调了STING途径的抑制15,49,抗原呈递受损16和增强的乳酸37或IL-6分泌13,50作为PD-(L)1抑制剂耐药性的潜在介质STK11MUT肿瘤。最后，观察到双重ICB减轻了STK11MUT和KEAP1MUT-相关的PD-(L)1抑制剂抗性表明这些基因可以用作鉴定将受益于CTLA4阻断的NSCLC患者的生物标志物。鉴于在患者亚组中解释事后分析的固有局限性，直接比较双重ICB和PD-(L) 的前瞻性临床研究1在这些亚组中结合化疗进行抑制-例如积极招募IIIb期TRITON临床试验 (NCT06008093)-是必要的，这些发现最终可能会改变具有这些最顽固肿瘤基因型的NSCLC患者的护理方式。
方法回顾性多机构nsNSCLC患者队列研究人群对来自北美和欧洲22个学术机构的患者进行了电子病历审查，包括MD安德森癌症中心，纪念斯隆凯特琳癌症中心，俄亥俄州立大学，达纳法伯癌症研究所，马萨诸塞州总医院，克利夫兰诊所，芝加哥大学，耶鲁大学，宾夕法尼亚大学，科罗拉多大学，科隆大学，UHN研究，哥伦比亚大学医学中心，Gustave Roussy，John's Hopkins，斯坦福大学，都灵大学Orbassano，加州大学戴维斯分校，加州大学洛杉矶分校、加州大学旧金山分校、莫菲特癌症中心和北卡罗来纳大学教堂山分校。接受 (a) 卡铂或顺铂，培美曲塞和帕博利珠单抗 (PCP队列) 或 (b) 卡铂或顺铂和培美曲塞治疗的IV期nsNSCLC患者在每个医疗管辖区 (CP队列) 的PCP监管批准之前，在治疗开始后存活14天或更长时间，并且具有包括STK11(对于PCP队列中的患者) 和STK11和/或KEAP1(对于CP队列中的患者) 在开始一线全身治疗之前可以从肿瘤或血液中获得。患有敏感肿瘤的患者EGFR突变或ALK重新安排被排除在外。作为一线全身治疗的一部分，使用贝伐单抗治疗的患者被排除在外。先前的免疫治疗是不允许的；如果在开始IV期疾病的全身治疗之前至少五个月完成，则允许对早期可手术切除的疾病进行新辅助或辅助化疗，或作为局部晚期疾病的同步放化疗的一部分。该数据集于2018年12月31日锁定用于PFS分析，并于2019年8月31日锁定用于OS分析。通过图表审查收集患者信息。PCP队列中88.6% 的患者可获得肿瘤细胞PD-L1表达，并使用Dako 22C3 pharmDx或28-8 pharmDx进行测定，ventana SP263或Ventana SP142和E1L3N测定 (关于所用测定的数据不可用于15名患者)。该研究由参与中心的机构审查委员会 (IRB) 批准，并包括患者知情同意的豁免。这项研究是根据道德准则进行的，包括赫尔辛基宣言和美国共同规则。基因组谱分析患者必须有基因组分析结果，包括STK11(对于PCP队列中的患者) 和STK11和/或KEAP1(对于CP队列中的患者) 在开始一线全身治疗之前来自肿瘤和/或血浆的患者包括在分析中。仅允许通过商业批准的测定或在CLIA认证的实验室中进行的测试。当可用时，我们整合了来自肿瘤和血浆分析的结果以进行分析。所有非同义词STK11和KEAP1错义突变和双等位基因缺失被认为是致病的。跨平台TMB协调是通过应用正常转换，然后标准化到z-分数如前所述51。协调TMB的阈值为每Mb 8.58个突变 (代表FoundationOne CDx测定中相当于每Mb 10个突变的全外显子组测序) 被用作分离低 (每Mb <8.58突变) 和高 (每Mb ≥ 8.58突变) TMB患者的截止值。生存和客观反应分析对于PFS分析，在最后一次放射肿瘤评估时截尾了在数据集锁定时存活且无进展证据或失访的患者的数据.对于OS分析，在数据集锁定时存活或失访的患者的数据在最后记录的患者接触时被截尾。采用kaplan-meier法评估PFS和OS，并通过对数秩检验评估差异。使用针对临床变量 (年龄，脑转移史，表现状态 (0-1 vs> 1)) 调整的分层Cox比例风险模型估计hr和相应的ci。最佳反应是通过研究者评估的RECIST v.1.1确定的。ORR定义为获得完全或部分反应的可评估反应的患者的百分比。在一线全身治疗开始后14天或更长时间但在第一次重新扫描之前死亡的患者被认为患有进展性疾病。将稳定的疾病归因于对治疗的最佳总体反应需要在第一个治疗周期 (C1D1) 的第一天与放射学评估之间至少间隔30天。分类变量的差异通过双侧Fisher精确检验进行评估。意义建立在P ≤ 0.05.在IBM SPSS Statistics v.24.0、R v.4.1.2 (2021-11-01) 和SAS v.9.4中进行统计分析。波塞冬III期随机临床试验数据集研究人群波塞冬全球III期随机临床试验 (ClinicalTrials.gov标识符: NCT03164616) 的研究设计和患者资格标准先前已被描述3。简而言之，如果患者年龄至少18岁，被诊断为IV期NSCLC，并且之前没有接受过转移性NSCLC的全身治疗; ECOG PS为0或1；并且根据RECIST v.1.1患有可测量的疾病。在随机分配之前，需要在中心实验室使用VENTANA PD-L1 (SP263) 免疫组织化学测定 (Ventana医疗系统) 进行肿瘤PD-L1表达评估。患有敏感肿瘤的患者EGFR突变或ALK重排没有资格参加研究。治疗和稳定的脑转移患者符合条件。治疗患者被随机分配 (1:1)，根据PD-L1表达 (≥ 50% 与 <50% 的肿瘤细胞)，疾病阶段 (IVA与IVB，根据国际肺癌研究协会胸部肿瘤学分期手册第8版) 和组织学 (鳞状与非鳞状) 的三个治疗组之一:(1) tremelimumab 75 mg加durvalumab 1，500 mg和最多四个21天周期的化疗，然后每4周一次durvalumab 1，500 mg，直到疾病进展 (PD)。在第16周/第6周期化疗后再给予一次tremelimumab剂量 (第五剂) (TDCT组); (2)durvalumab 1，500 mg加化疗，最多四个21天周期，然后每4周一次durvalumab 1，500 mg，直到PD (DCT组); 或 (3) 铂类双重化疗长达六个21天周期 (CT组)。仅波塞冬登记的nsNSCLC患者被纳入分析。非鳞状组织学患者的化疗选择包括顺铂或卡铂和培美曲塞，或者卡铂和nab-紫杉醇。如果符合条件，接受培美曲塞-铂类双重治疗的非鳞状组织学患者可以接受培美曲塞维持治疗。患者继续治疗直到PD，不可接受的毒性或撤回同意书。不允许在研究中交叉。该研究是根据赫尔辛基宣言和国际协调会议良好临床实践指南进行的。该方案和所有修改均已获得相关伦理委员会和监管机构的批准。所有患者均提供书面知情同意书。终点和统计分析主要终点是无进展生存期 (PFS)，根据RECIST v.1.1通过盲法独立中央审查 (BICR) 评估，以及DCT与CT的总生存期 (OS)。PFS定义为从随机分配到客观PD或无进展情况下任何原因死亡的时间，OS定义为从随机分配到任何原因死亡的时间。关键的 α 控制次要终点是TDCT与CT的PFS和OS。在主要终点和 α 控制的次要终点中使用了带有看门策略的分层多重测试程序。首先，将1% α 和4% α 分别分配给PFS和OS，用于DCT与CT比较。任一主要终点的阳性使关键次要PFS和OS终点 (TDCT与CT) 的 α 再循环成为可能。如果满足关键次要PFS或OS终点中的任一个，则alpha可以再循环到另一个关键次要终点。主要和关键的次要PFS和OS分析使用分层时序检验进行，调整了肿瘤PD-L1表达，疾病分期和组织学的分层变量。使用分层Cox比例风险模型估计HRs和95% ci。使用逻辑回归模型分析ORR，调整与主要终点相同的因素，并计算比值比和95% ci。采用kaplan-meier法计算OS、PFS和DoR中位数。在生物标志物可评估的nsNSCLC群体中分析功效数据。波塞冬生物标志物分析通过Foundation Medicine的组织FoundationOne CDx测定和Guardant Health的ctDNA GuardantOMNI测定，对治疗前的肿瘤组织或血浆样品进行了DNA的下一代测序 (NGS)。使用VENTANA PD-L1 (SP263) 免疫组织化学测定法对治疗前肿瘤组织样品的PD-L1的肿瘤细胞表达进行评分，阳性截止值为1% 或50%。如前所述对TMB进行了评估52。样本被认为在STK11或KEAP1如果检测到已知的非同义体细胞突变，如OncoKB中所述53,任何截短的改变，包括移码插入和缺失，外显子2 bp内的剪接位点突变，或一个或多个外显子的纯合缺失; 和改变为KRAS如果检测到已知的错义体细胞热点突变。使用kaplan-meier估计进行PFS (通过 (BICR) 根据RECIST v.1.1) 和OS的探索性分析，使用非分层Cox比例风险模型估计hr和95% ci。根据RECIST v.1.1，使用BICR的确认反应 (至少一次完全反应或部分反应的访问反应，以及不超过初始反应后四周的确认扫描) 计算orr。Kaplan-meier估算值用于描述缓解持续时间，定义为从首次记录完全缓解/部分缓解到进展日期的时间。在没有进展的情况下死亡或在两次或更多次错过就诊后进展或死亡的患者的最后可评估的RECIST评估。使用SAS v.9.4和R v.4.2.0进行分析。基础医学队列在TMB的综合分析中，包括8，592名未经选择的LUAD患者，他们将样本提交给FMI进行基于杂交捕获的综合基因组分析，单个癌症相关基因的PD-L1表达和基因组改变。本研究获西方机构审查委员会批准，包括放弃知情同意和HIPAA放弃授权 (方案编号20152817).提交给Foundation Medicine的样品在CLIA认证的实验室进行处理，如前所述54。如前所述，TMB由基础医学测量52。原始TMB值以每个Mb测序的突变为单位进行测量，并表征为低 (TMB < 6)，中 (6 ≤ tmb < 20) 或高 (TMB ≥ 20)。FMI群组中肿瘤细胞PD-L1表达的评估基于dako22c3pharmdx测定。肿瘤的特征是PD-L1阴性 (PD-L1 TPS < 1%)，低阳性 (PD-L1 TPS 1-49%) 或高阳性 (PD-L1 TPS ≥ 50%)。在FMI队列中，LUAD样本被认为在STK11或KEAP1如果检测到已知或可能的致病性非同义体细胞突变，则为任何截短改变或双等位基因丢失。通过双侧Fisher精确检验评估统计分析，并在FDR调整后确定显著性。P ≤ 0.05.MD安德森癌症中心mIF队列在MD安德森癌症中心获得的手术切除的早期人类NSCLC标本通过多重免疫荧光 (mIF) 进行评估，方法与先前描述的方法相似55。简而言之，使用自动染色系统 (bond-rx; Leica Microsystems) 对4微米厚的福尔马林固定，石蜡包埋的肿瘤切片进行染色，应用先前经过验证的mIF抗体组55。根据蛋白石7color IHC试剂盒 (NEL797001KT; Akoya Biosciences) 中每个相应的荧光团依次进行染色，包括DAPI和蛋白石Polaris 520、540、570、620、650，690和香豆素。使用多光谱显微镜，PhenoImager HT (以前称为Vectra Polaris) 1.0.13成像系统 (Akoya Biosciences) 扫描染色的组织微阵列 (TMA) 载玻片，在10x低放大倍数和20x高放大倍数的荧光下。使用InForm 2.8.2图像分析软件 (Akoya Biosciences) 分析来自tma的每个核。标记物共定位用于鉴定不同的细胞表型并定量每毫米的细胞数量2。使用RStudio 3.5.3 (Phenopter 0.2.2；https:// rdrr.io/github/akoyabio/phenoptrReports/f/,Akoya生物科学)。通过全外显子组测序 (WES) 获得基于NGS的基因组分析或CLIA认证的临床NGS测定作为常规护理标准的一部分，并作为IRB批准的研究方案的一部分进行访问。ICON非小细胞肺癌队列分析来自ICON队列中登记的患者的肿瘤样本56对于nsNSCLC组织学，没有先前的新辅助化疗和可用的转录谱数据被认为是合格的 (n = 57)。使用来自deseq2的vsd函数对原始rna-seq数据进行归一化和转化。Z-分数和平均基因表达数据用于免疫细胞亚群的基于签名的评估。TH1水平和整体免疫浸润 (ImmuneScore) 被估计为使用XCell的基因签名57并根据存在的情况进行绘制STK11和/或KEAP1使用先前验证的LKB1缺乏症的信号进行体细胞突变或功能状态58或NRF2转录激活8。中性粒细胞、巨噬细胞和CD8+用MCPCounter评估T细胞特征数据以获得每个样品的比率。所有分析均使用Python v3.9和R v.4.3.1进行。TCGA PanCancer Atlas肺腺癌数据集的分析来自TCGA pancer Atlas队列的LUAD患者的配对WES，rna-seq和临床数据从癌症基因组学库的cBioPortal下载59。使用TIMER2.0的汇总数据估算免疫细胞亚群60,它提供了六种不同免疫估计方法的标准化输出。中性粒细胞、巨噬细胞和CD8+用MCPCounter评估T细胞特征数据以获得每个样品的比率。使用QuanTIseq比较跨突变组的T细胞和非调节性CD4水平。整体免疫浸润 (ImmuneScore) 和TH1个水平被估计为使用XCell的基因签名57。使用kruskal-wallis H检验进行组间比较。使用R v.4.0.3进行分析。免疫逃避和PD-1抑制剂抗性驱动因素的体内CRISPR-Cas9筛选图书馆设计与建设我们建立了一个针对162个基因的1，813个sgrna文库，重点关注癌症中功能缺失突变或缺失的基因。此外，我们包括已知的必需基因，免疫抗性基因和免疫致敏基因，以评估和验证体内筛选平台。文库中包含的11% 的sgrna代表非靶向对照。将sgRNA寡核苷酸克隆到皮孔病毒v2质粒中61,使用Gibson程序集。细胞系工程3lllewis肺癌细胞系购自JCRB细胞库。3LL细胞在含有10% 热灭活胎牛血清 (FBS) 的RPMI-1640中于37 °C和5% CO的条件下生长。2。293FT细胞购自Invitrogen，并在具有10% 热灭活FBS的Dulbecco改良Eagle培养基 (DMEM) 中生长。使用lipofectamine3000 (Invitrogen) 转染文库质粒加上包装辅助质粒psPAX2和pVSVG，在293FT细胞中产生慢病毒载体文库。转染后66小时收集含有病毒的上清液，并通过超速离心浓缩。用sgRNA文库以30% 的感染率转导3LL细胞，并在感染后4天进行嘌呤霉素选择以产生稳定的细胞。细胞在培养中传代几次，以允许有效的基因编辑。体内CRISPR筛选体内筛选在中国无锡AppTec进行。研究设计获得了药明康德机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。6-8周龄BALBc裸鼠和C57BL/6J小鼠，购自上海SLAC实验动物有限公司，用于筛选，2 × 106将文库转导的3LL细胞重悬于0.1ml磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中，皮下注射到右侧。当平均肿瘤体积达到约40-60毫米时，将小鼠分组进行治疗。3在第0天。C57BL/6J小鼠通过腹膜内注射5 mg/kg或10 mg/kg的anti-mPD-1 (BioXCell，BE0146) 或anti-IgG2a (BioXCell，BE0089) 进行治疗。每周两次，持续两周。每隔一天测量一次肿瘤，并用公式 (L×W2)/2。当该组的平均肿瘤体积达到约1，000？Mm时，对小鼠实施安乐死并收集肿瘤用于基因组DNA提取。3。分别在第11天和第13天收集来自裸鼠组和C57BL/6组的肿瘤。对于基因组DNA提取，通过FreezerMill在液氮中研磨肿瘤组织。根据制造商的方案，使用血液和细胞培养DNA Midi试剂盒或迷你试剂盒 (Qiagen) 将组织粉末用于DNA提取。数据分析如前所述进行基因组DNA分离和测序62。为了标准化每个样品中sgRNA指南的原始计数，通过非靶向对照向导的中值计数与质粒池之一的比率来确定样品特异性大小因子。通过将每个样品的样品特异性大小因子相乘并将所有值加1来缩放原始计数。日志2-使用控制臂作为参考，计算每个扰动臂中每个sgRNA的转化倍数变化，并对生物学重复进行平均。基因级日志2-通过平均靶向相同基因的sgrna来计算转化的倍数变化。原始sgRNA计数也用作MAGeCK的输入，以使用MAGeCK Python软件包v.0.5.7调用显着富集和耗尽的基因63,64。当运行MAGeCK时，选择非靶向sgrna的中值比率作为归一化方法。基因水平得分矩阵包括日志2-变换的折叠变化，FDR和P值。体内多重评估TSG对单个和双重ICB的选择性损失脆弱性Kras G12D-使用Tuba-seq驱动的LUADLenenti-sgrna/Cre载体的设计与生成我们产生了编码Cre的慢病毒载体 (从PGK启动子表达65) 和靶向以下22个基因中的每一个的sgRNA (从人U6启动子表达)，这些基因是在LUAD (或泛癌) 中反复突变的已知或推定的肿瘤抑制基因代表不同的癌症途径66,67:Apc,Arid2,自动取款机,Atrx,Brca2,Cdkn2a,Cmtr2,Keap1,Kmt2d,Mga,Nf1,Pten,Ptprd,Rb1,Rbm10,Rnf43,Setd2,Smad4,Stag2,Stk11,Trp53和Tsc1。还产生了编码 “惰性” sgrna的载体: sgRosa26-1、sgRosa26-2、sgRosa26-3、sgNT-1、sgNT-2和sgNT-3。Sgrna的设计和选择如下。首先，使用可用的sgRNA设计/评分算法，鉴定靶向每个目的基因的所有可能的20 bp sgRNA (使用NGG PAM)，并对预测的靶上切割效率进行评分68。对于每个TSG，我们然后选择预测最有可能产生无效等位基因的sgRNA: 优先考虑先前在体内验证的sgRNA32,69,70,具有最高的预测目标切割效率，在所有已知剪接同工型 (ENSEMBL) 中保守的靶向外显子，靶向剪接受体/剪接供体位点最早位于基因编码区，发生在带注释功能域的上游或内部 (InterPro; UniProt)，并发生在人类LUAD的上游或已知的复发突变位点。补充表中列出了每个靶标的sgRNA序列1。为了产生含有每个sgRNA的lenti-sgrna/Cre载体，双链DNA片段 (IDT gBlock) 含有侧翼为限制性位点 (AscI和SbfI) 的U6-sgRNA-tracrRNA盒通过AscI和SbfI合成和消化。然后将该消化的DNA片段克隆到编码Cre的AscI/SbfI消化的亲本慢病毒载体中，以产生每个环化的lenti-sgrna/Cre载体。Lenti-sgrna/Cre的条形码多样化为了能够使用高通量测序平行定量单个肿瘤中的癌细胞数量，我们用46 bp多组分条形码盒使lenti-sgrna/Cre载体多样化，通过将慢病毒载体稳定整合到初始转导细胞中，每个肿瘤都是独一无二的。该46bp的DNA条形码盒由对载体骨架 (vectorID) 特异性的已知6个核苷酸的ID、对每个单独的sgRNA (sgID) 特异性的10个核苷酸的ID组成。和含有20个简并碱基的30个核苷酸的随机条形码 (随机BC)。每个sgRNA的46bp条形码盒侧翼为通用illuminatruseq衔接子序列，并合成为单链DNA寡核苷酸。正向和反向引物与通用TruSeq序列互补，并包含带有限制酶位点 (AscI和NotI) 的5' 尾巴在PCR反应中用于产生和扩增用于克隆的双链条形码盒。用AscI和NotI消化每个lenti-sgrna/Cre载体及其匹配的插入条形码PCR产物。为了产生大量独特的条形码载体，我们在100微升连接反应中连接1微升线性化载体和50微升插入物与T4 DNA连接酶。在室温下孵育四到五个小时后，通过在加入5微升糖原 (5微升毫克毫升) 后以14，000 °rpm离心12 °min沉淀连接的DNA− 1) 和280微升100% 乙醇加入连接反应。将DNA沉淀用80% 乙醇洗涤并风干，然后用10 μ l水重悬。按照制造商的说明，使用bio-rad电穿孔系统将该10微升充分溶解的DNA转化为100微升的SURE电感受态细胞。通过添加到5ml预热的SOC培养基中立即回收电穿孔转化的细胞。从这些5ml细菌中，用LB氨苄青霉素肉汤进一步稀释10 μ l，并将1:200，000的最终稀释度铺在LB氨苄青霉素板上，用于在37 °C下孵育。将剩余的细菌轻轻彻底混合，然后接种到100 °mllb氨苄青霉素肉汤中，在37 °C下以220 °rpm振荡过夜。第二天，计数LB氨苄青霉素平板上的菌落数以估计每个文库的复杂性，并沉淀100 °ml细菌培养物用于质粒纯化。挑取来自每个文库的八个菌落，并进行PCR筛选以验证这八个菌落中的特异性sgRNA序列和相应的条形码序列。再次对每个文库的最终纯化的文库质粒进行序列验证。慢病毒的生产、纯化和滴定转染前24小时，2.4 × 107将293t细胞接种在15cm组织培养板上。30微克pPack (包装质粒混合物) 将15 μ g文库质粒DNA在1.5 μ ml无血清DMEM中充分混合，然后加入等体积的含有90 μ l LipoD293的无血清DMEM。将所得混合物在室温下孵育10-20 °c，然后加入293t细胞中。转染后24 °h，将含有复合物的培养基替换为30 °ml补充有10% FBS，dna酶I (1单位/ml)，MgCl的新鲜DMEM2(5 °mm) 和20 °mm HEPES，pH 7.4。收集来自每个平板的整个含有病毒的培养基，并在转染后48小时通过0.2μmpes过滤器 (Nalgene) 过滤。通过以18，500 °C，4 °C离心2小时进一步浓缩病毒，并将沉淀重悬于500 °lpbs缓冲液中。将50微升的病毒等分试样储存在-80 °C。为了定量包装的文库构建体的滴度，105Lsl-yfp MEF细胞71在含有5 µ g ml的1 ml培养基中用1 µ l病毒转导− 1polybrene。将转导的细胞孵育72 °c，然后收集用于FACS分析以测量YFP阳性细胞的百分比。平行使用对照病毒以使病毒滴度标准化。Lenenti-sgrna/Cre向量的池化为了产生一个条形码编码的lenti-sgrna/Cre载体池，用于在单个小鼠中启动多种肿瘤基因型，针对上述22个基因的条形码编码的lenti-sgrna/Cre载体 (Apc,Arid2,自动取款机,Atrx,Brca2,Cdkn2a,Cmtr2,Keap1,Kmt2d,Mga,Nf1,Pten,Ptprd,Rb1,Rbm10,Rnf43,Setd2,Smad4,Stag2,Stk11,Trp53和Tsc1) 和含有惰性，阴性对照sgrna的那些组合，使得病毒相对于其估计的体外或体内滴度具有相等的比率。用ixdulbecco's磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 稀释病毒库以达到180，000转导单位 (TU) 的滴度。用于体内研究的小鼠，肿瘤起始和组织收集KrasLSL-G12D和H11LSL-Cas9等位基因以前已经描述过71,72。共有125名男性和女性KrasLSL-G12D/+H11LSL-Cas9/LSL-Cas9(KC) BL6背景 (B6J) 中的小鼠，范围为14至22周龄，于2020年2月19日从Jackson实验室接收。将小鼠每笼饲养5只，并在研究开始前适应环境。房屋位于带有高压灭菌自来水的无病原体通风架中。随意给予食物和水。通过耳标单独鉴定小鼠。由Pionyr免疫疗法进行的研究在Explora BioLabs的IACUC的指导下并得到其批准。在2 × 10的异氟烷麻醉下，通过气管内递送，在15-23周龄的小鼠中引发肺肿瘤4-5 × 105包含针对上述22种不同基因的条形码lenti-sgrna/Cre载体的慢病毒池的TU (Apc,Arid2,自动取款机,Atrx,Brca2,Cdkn2a,Cmtr2,Keap1,Kmt2d,Mga,Nf1,Pten,Ptprd,Rb1,Rbm10,Rnf43,Setd2,Smad4,Stag2,Stk11,Trp53和Tsc1)，以及针对NeoR基因的三个sgrna (sgNeo-1，sgNeo-2和sgNeo-3) 和三个非靶向sgrna (sgNT-1，sgNT-2和sgNT-3)。在转导后肺肿瘤发展12周后，在开始治疗之前，将小鼠随机分成4组，每组20只小鼠 (在性别上平均分布)。基于每组的平均体重，每五天用指定抗体腹膜内给药小鼠。在整个研究的活体部分中，每周两次检查个体体重和健康监测。对小鼠组群进行如下处理:第1组: 小鼠IgG1同种型对照 (克隆MOPC-21) 和小鼠IgG2a (非岩藻糖基化形式的克隆C1.18.4) 以5 °mg/kg腹膜内递送 (IP)，每日一次给药，每5天持续2周，直到肿瘤开始后14周时脱落。第2组: Anti-PD-1 (克隆RMP1-14重组产生为小鼠IgG1 D265A格式) IP递送，以5 °mg/kg每日一次给药，每5天持续2周，直到肿瘤开始后14周时脱落。第3组: Anti-CTLA4 (在BioXcell上产生的小鼠IgG2b形式的克隆9D9，BP0164) 以10 °mg/kg每日一次给药IP递送，每5天持续2周，直到肿瘤开始后14周时脱落。第4组: Anti-PD-1 IP递送，5 mg/kg，anti-CTLA4 IP递送，10 mg/kg，每日一次给药，每5天持续2周，直到肿瘤开始后14周时脱落。治疗后，如前所述从安乐死的小鼠中提取整个肺组织。32。记录肺质量测量值作为总体肺肿瘤负荷的代表，然后在随后的NGS处理之前储存在-80 °C (参见下面的部分)。双链DNA掺入对照的产生DNA条形码盒包含46-bp条形码盒，侧翼为universal Illumina TruSeq衔接子序列以及额外的缓冲液序列，以将其总长度延伸至超过400 °bp，通过直接合成双链DNA片段 (GeneWiz，IDT) 或通过合成单链DNA寡核苷酸 (GeneWiz，IDT)具有重叠的互补区域，通过PCR延伸和扩增以产生双链DNA产物，然后纯化。使用不含DNase的超纯H将这些储备双链DNA片段的等分试样稀释至所需的拷贝数。2O并储存在 − 20 °C。细胞刺突对照的产生包含已知的46bp序列的DNA条形码盒侧翼为通用illuminantruseq衔接子序列，并合成为单链DNA寡核苷酸。与通用TruSeq序列互补的正向和反向引物，并含有带限制酶位点的5' 尾 (Xba1和BstB1) 在PCR反应中用于产生和扩增用于克隆的双链条形码盒。通过Xba1和BstB1限制酶消化慢病毒载体pRCMERP-CMV-MCS-EF1-TagR-Puro和每个条形码插入PCR产物。通过t4dna连接酶将每个消化的条形码插入物克隆到线性化载体中，并转化到OmniMax化学感受态细胞 (Invitrogen) 中。通过PCR和测序筛选来自每个转化板的菌落。培养来自每个含有条形码的构建体的一个阳性克隆用于质粒DNA提取。使用pPack包装混合物和LipoD293试剂将来自每个条形码化的pRCMERP构建体的病毒包装在六孔板中。在转染后48小时收集含有病毒的培养基，并用nalgene0.2μmpes过滤器过滤，然后在-80 ℃ 下以等分试样冷冻。将冷冻病毒的小等分试样解冻并加入到12孔板中的HEK293细胞中，用于在转导后72小时通过FACS分析测量滴度。为了产生含有每个条形码构建体的单个细胞系，将含有病毒的培养基以0.1的感染复数在iocm平板中添加到HEK293细胞中。过夜孵育后，将细胞在新鲜的EMEM完全培养基中回收48 °h，然后分成含有1 °μ g °ml的新平板− 1puro在完整的EMEM介质中进行puro选择。在puro选择三天后，将含有条形码的HEK293细胞在不含puro的新鲜EMEM完全培养基中再回收三天，然后在iocm平板中进一步扩增。通过来自基因组DNA的条形码区域的PCR扩增对每个建立的细胞系进行质量控制，以确认正确的条形码序列的整合。在细胞扩增后，收集来自每个条形码化的HEK293细胞系的细胞，并在含有0.1% BSA的PBS缓冲液中稀释至所需浓度。将这些细胞悬浮液等分并在-80 °C下冷冻。小鼠肺基因组DNA的分离从冰箱中取出整个肺并使其在室温下解冻。将Spike-in添加到每个全肺样品中。如制造商方案中所述，加入来自qiagenetrupuregene组织试剂盒 (158689) 的Qiagen细胞裂解缓冲液和蛋白酶K。使用组织匀浆器 (FastPrep-24 5g，mpbiomedicals 116005500) 在细胞裂解缓冲液和蛋白酶K溶液中匀浆来自每只小鼠的全肺和掺入物。将均质化的组织在55 °C下孵育过夜。为了从每个组织样品中去除RNA，将RNA酶A与另外的掺入物一起添加到整个均质化的组织中。为了保持所有肿瘤的准确表示，提取DNA，并使用qiagentra PureGene试剂盒从整个肺裂解物中沉淀乙醇，如制造商的方案中所述。将更多的spike-in加入到重悬的DNA中。用于测序的条形码文库的制备通过从每只小鼠32 μ g基因组DNA扩增条形码区域来制备文库。整合的lenti-sgrna/Cre载体的条形码区域使用引物对进行PCR扩增，所述引物对结合通用illuminaltruseq衔接子并含有双重独特的多重标签。我们使用了条形码区域的单步PCR扩增，我们发现这是一种高度可重复和定量的方法来确定每个肿瘤中癌细胞的数量。我们使用Q5 HF HS 2X主混合物 (NEB M0515) 和补充表中所述的PCR程序，每只小鼠进行了8次100微升PCR反应 (每个反应4微升DNA)2。通过TapeStation (agilenttechnologies) 测定每个PCR中扩增的条形码产物的浓度。以等摩尔比的条形码产品合并20-60组pcr，归一化至与pcr相关的每个小鼠肺样品中估计的肿瘤负荷 (测量的肺质量减去0.15至0.18 °g之间的估计的正常肺质量)。使用双侧SPRI珠纯化来清除合并的pcr。在illuminanextseq上对样品进行测序。测序数据分析使用BCLConvert (v.3.8.2) 通过独特的双重索引对双端测序读数进行解复用，并使用CutAdapt (v.4.1) 修剪衔接子序列。CutAdapt在具有以下参数的双端模式中使用: 最小长度 = 0，错误率 = 0.1，重叠 = 3。使用Bowtie2 (v.2.4.4) 在预期的寡核苷酸掺入和肿瘤条形码插入序列的配对读取和文库特异性数据库之间构建配对末端比对。如果这些比对不符合几个质量标准中的任何一个，则从下游分析中严格过滤，包括:
[*]在任何位置，完全重叠的两个配偶对之间没有错配。
[*]在配对的读段与它们最佳对齐的条形码或掺入的预期恒定区之间没有错配。
[*]在配对读段与它们最佳对齐的条形码或尖峰之间的对齐中没有插入缺失。
比对后，使用简单的贪婪聚类算法纠正了双端读数中的错误:
[*]读取被解重复为读取序列/计数元组，(s我,右我)。
[*]这些元组根据其读取的丰度从最高到最低重新排序，(右我) (参考文献。6,13,49,63)。
[*]这个元组列表是从我 = 1…N,对每个元组执行以下操作之一 (s我,右我):
[*]如果s我与任何sj与j < 我,然后 (s我,右我) 启动新的集群。
[*]如果sj在距离某个sj与j < 我,然后它加入的集群sj。
所得到的簇各自被认为表示与建立簇的序列相等的经错误校正的序列，其中读取计数等于群集的成员。执行第二阶段的错误校正以移除额外的错误。汉明距离D(s我,sj) 是在所有对纠错序列上计算的。然后，每个序列s我(与右我Read) 被吸收到最丰富的序列中sj(与右j>右我如果满足以下任一标准，则读取):
[*]D(s我,sj) ≤ 3
[*]D(s我,sj) ≤ 5和右j/右我 ≤ 5或右我 ≤ 3.
这些启发式方法是在内部控制数据的基础上建立的。在应用两轮错误校正后，在分配给未添加到样品的掺入寡核苷酸序列 (其不具有简并碱基) 的18，889，362个读数中存在0个假阳性。纠错后，应用过滤器以去除可能源自交叉污染的序列: 在同一研究中，跨样品比较条形码，并且移除在多于一个文库中发现的任何精确序列。纠错和消除交叉污染后，通过除以在固定的组织匀浆和裂解之前添加到样品中的spike-in寡核苷酸的读段数，将每个独特条形码的读段数转换为肿瘤细胞数，已知浓度。去除在转导过程中没有获得足够病毒滴度的小鼠序列处理后，如果小鼠未达到总肿瘤细胞的下限，则将其移出。如果小鼠少于10只，则将其移除6肿瘤细胞总数。通过检查每个研究中每只小鼠的总肿瘤细胞的分布来选择该阈值。大多数小鼠落在彼此的大约两个数量级内，并且任何异常值都至少比分布的其余部分低一个数量级。药物基因组相互作用的计算从药物治疗和媒介物治疗的小鼠的成对组的肿瘤大小的这些集合，如前所述计算相对肿瘤数 (RTN) 度量。73。也就是说，惰性肿瘤的收缩是通过发现S与大于截止值的肿瘤中位数相匹配L在这样的配对组中，用载体治疗后的肿瘤大小乘以S(S 当药物起到缩小肿瘤的作用时， < 1)。随后，对于每个非惰性肿瘤基因型，具有该基因型的肿瘤数量的比率大于L在对照小鼠中，肿瘤的数量大于L × S在治疗的小鼠中计算。将所得比率除以为惰性肿瘤计算的相同比率，并将对数2确定该比率的 (•)。此度量，RTN得分预计抗性基因型大于0，敏感基因型小于0。例如，RTN得分 = 1对应于肿瘤数量的2倍变化 (大于每个截止值)，相对于仅癌基因肿瘤的未治疗与治疗的变化，而RTN得分 = − 1对应于0.5倍的变化和药物敏感性。为RTN生成ci得分,通过以下方式进行自举重采样 :( 1) 从对照组和治疗组中替换小鼠以匹配原始组大小，以及 (2) 采样肿瘤 (所有大小) 替换每只老鼠。对于每只小鼠/肿瘤引导，RTN得分被重新计算。如果这些引导RTN的第95个百分位数，则认为基因型是敏感的得分值低于0，如果第5个百分位数超过0，则为抗性。我们在肿瘤大小的截止值范围内执行了此自举程序L = 300个单元格L = 30，000个单元格。RTN分数还使用与药物治疗与媒介物比较相同的方法，将anti-PD-1和anti-CTLA4组合治疗与anti-PD-1单一疗法进行比较。肿瘤大小百分位数的计算首先，将载体组中所有小鼠的肿瘤合并，并分成映射到每个lenti-sgrna/Cre指南的肿瘤。合并来自lenti-sginert/Cre的肿瘤 (sgNT-1，sgNT-2，sgNT-3，sgRosa26-1，sgRosa26-2，sgRosa26-3) 以创建一个sgInert肿瘤池。对于该分析，我们使用具有至少500个肿瘤细胞的所有肿瘤，这是我们在本研究中可以可靠地量化的最小肿瘤大小。对于每个癌基因-背景对中的每组lenti-sgrna/Cre肿瘤，计算高于500个细胞截止值的肿瘤的大小百分位数，并将其除以具有相同截止值的相同上下文中的sgInert肿瘤的相同大小百分位数。将小鼠和肿瘤自举200次，并且每次重复计算。据报道，这些引导的置信区间为95%。动物队列和免疫能力的产生Stk11-和/或Keap1-缺乏同系非小细胞肺癌模型将小鼠安置在德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究动物支持设施中。此处描述的所有动物研究均根据德克萨斯大学MD安德森癌症中心IACUC批准的方案进行，并根据预先指定的安乐死标准，肿瘤大小限制和动物队列样本量。研究人员对治疗组的分配并非不知情。的KL5和KL2多克隆KrasG12C-变种人Stk11-在复合条件下从自体肺肿瘤中建立了缺陷型LUAD细胞系KrasLSL-G12C +/重量Stk11/Lkb1左/左雄性小鼠 (C57Bl/6遗传背景)，如前所述，鼻内滴注腺病毒Cre重组酶 (爱荷华大学病毒载体核心) 诱导肺肿瘤后74并用于在性别匹配的 (雄性) 同基因受体C57Bl/6小鼠中建立皮下同种异体移植肿瘤。LKR10和LKR13KrasG12D-突变的LUAD细胞 (在129/Sv遗传背景上，先前在T实验室中生成。杰克) 被瞬时转染Keap1CRISPR-Cas9 KO质粒 (sc-424513-KO-2) 或Stk11/Lkb1CRISPR-Cas9来自santacruzbiotechnology的KO质粒 (sc-423192) (LKR10衍生模型) 或具有特异性sgrna的pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) 质粒 (LKR13衍生模型)。CRISPR-Cas9-mediated的质粒载体Keap1和Stk11/Lkb1KO通过DNA测序验证。通过bdfacsaria (bdbiosciences) 对转染的细胞进行GFP分选。+在96孔板和单细胞衍生的集落中通过western印迹筛选KEAP1和LKB1损失。在同系肿瘤模型中进行anti-PD-1和anti-CTLA4的体内临床前研究6-12周龄雄性C57BL/6小鼠 (用于实验KL2和KL5细胞系) 和雄性129/Sv小鼠 (用于LKR10和LKR13-derived等基因细胞系的实验) 皮下注射1.5 × 106100 μ l悬浮液中所示基因型的细胞，由50% Matrigel基底膜基质 (Corning) 和50% HBSS组成。患有皮下肿瘤的小鼠，平均肿瘤体积 (TV) 为150至250 °mm3(用于长期疗效研究) 或50至100毫米3(用于免疫分析，免疫耗竭和iNOS化学抑制研究) 被随机分配接受 (i) anti-PD-1 200 μ g (克隆29F.1A12，BioXCell); (ii) anti-CTLA4 200 µ g (克隆9H10，BioXCell); (iii) anti-PD-1 + anti-CTLA4; 或 (iv) 相应的同种型IgG对照抗体 (BioXCell；BE0089和BE0087) 通过IP注射每周两次。每天监测小鼠，并根据双向测径器肿瘤测量结果，每周计算三次TV，使用公式V = W2L/2。在任何治疗组中的第一只小鼠达到终点时 (定义为TV ≥ 1，200 mm3或1，500 mm3取决于个体实验)，但在剩余的小鼠中继续进行治疗，以使时间与1，200 °mm的肿瘤体积进行比较3或者更大。对于双重anti-PD-1/anti-TIM-3和anti-PD-1/抗LAG-3 ICB实验，小鼠KL5同种异体移植肿瘤 (TV 50-100mm3,肿瘤植入后第5天) 随机接受 (i) anti-PD-1 200 µ g (克隆29F.1A12，BioXCell) 加anti-CTLA4 200 µ g (克隆9H10，BioXCell) 治疗; (ii) anti-PD-1加anti-TIM-3 200 µ g (克隆B8.2C12，BioXCell); 或 (iii) anti-PD-1加抗LAG-3 200 µ g (克隆C9B7W，BioXCell)通过IP注射每周两次，并如上所述进行监测。免疫细胞耗竭和INOS化学抑制研究CD4+和CD8+通过每周两次腹膜内施用400 μ g anti-CD4 (克隆GK1.5，BioXCell) 或anti-CD8 (克隆2.43，BioXCell) 消耗单克隆抗体进行T细胞消耗。从皮下植入1.5 × 10后第4天开始6 KK或KL5肿瘤细胞。通过腹膜内施用400 μ g anti-Ly6G抗体 (克隆1A8，BioXCell) 和/或200 μ g anti-CCL2抗体 (克隆2H5，BioXCell) 实现嗜中性粒细胞消耗和/或CCL2中和从肿瘤细胞注射前第-3天开始，然后每周两次施用100 μ g anti-Ly6G或200 μ g anti-CCL2。如前所述，通过每日腹膜内注射稀释在100 μ L PBS中的200 μ g l-nil (Cayman Chemicals) 来抑制iNOS42。在第5天开始用anti-PD-1/ anti-CTLA4治疗，此时小鼠队列表现出50-100mm的平均肿瘤体积3并遵循与上述相同的时间表。化疗免疫治疗的临床前实验携带皮下同种异体移植的雄性129/Sv小鼠的队列K(LKR13 KrasG12D突变体；Keap1/Stk11WT) 或等基因KLK(Keap1-和Stk11-缺陷型，克隆17) 同种异体移植肿瘤被随机分配到 (化学) ICI治疗组，平均肿瘤体积约为210？Mm3。化疗包括卡铂12.5毫克每公斤 (机构药房，NDC 61703-339-56) 通过IP注射每7天 (最多4剂) 和紫杉醇5 °mg/kg (NDC 70860-200-50) 通过IP注射每周两次 (最多8个剂量) 给药。Anti-PD-1 (克隆RMP1-14，BioXCell; 8 mg/kg) 和anti-CTLA4 (克隆9H10，BioXCell; 8 mg/kg) 通过IP注射每周两次给药，直到达到研究终点。流式细胞术对于免疫调节的研究，在皮下肿瘤植入后第5天开始用单一或双重ICB治疗，并遵循与先前针对功效实验所述相同的给药方案。在第18天，在五个剂量的单或双ICB之后收集肿瘤样品。用于化学免疫治疗实验K和KLK(克隆17) 模型，小鼠接受总共三种剂量的化学疗法和/或免疫疗法 (D1: 卡铂 + 紫杉醇 + ICB); D4 (紫杉醇 + ICB)；d7 (卡铂 + 紫杉醇 + ICB)，并在48小时后收集肿瘤用于基于FACS的免疫谱分析。肿瘤立即加工成2-4-mm3碎片并转移到装有liberase溶液的绅士acs Octo解离器管中 (25 μ g ml− 1)，脱氨酶I型1 (30 u ml− 1) 和透明质酸酶 (0.01%) 在无血清RPMI-1640培养基中，并在37 °C下孵育45 °C。通过添加冷RPMI-1640 (10% FBS) 终止酶反应，并将悬浮液通过70μm细胞过滤器分散两次。红细胞裂解后 (使用RBC裂解缓冲液，Biolegend)，单细胞悬浮液 (约1 × 106将总体积为50 °l的细胞) 与FcR阻断剂大鼠抗小鼠CD16/32 (2.4 g2，bdbiosciences) 在冰上孵育15 °min。对于细胞外染色，将细胞用FACS缓冲液中的缀合抗体的混合物 (包括重影染料紫510 (thermofisherscientific)) 在室温下在黑暗中染色1 °c。对于细胞内细胞因子和转录因子染色，根据制造商的说明，使用eBioescience FoxP3/转录因子染色试剂盒 (lifetechnologies) 将单细胞悬浮液固定并透化。荧光染料缀合的单克隆抗体购自Biolegend: 太平洋Blue-anti-CD45 (30-F11)，PE/Dazzle 594 anti-CD3 (17A2)，APC/Cy7-anti-CD4 (RM4-5)，PE/Cy7-anti-CD8 (53-6.7) 、apc-anti-t-bet (4B10) 、PE-anti-icos (7E.17G9) 、BV711-anti-CD44 (IM7) 、BV605-anti-PD-1 (29F.1A12) 、BV711-anti-Gr-1 (RB6-8C5) 、BV785-anti-CD11c (N418) 、BV650-anti-CD11b (M1/70) 、PE/Cy7-anti-I-A/i-e(MHC II类，M5/114.15.2)，BV605-anti-Ly6C (HK1.4)，PerCP/Cy5.5-anti-Ly6G (1A8); 来自BD生物科学: BUV395-anti-CD25 (PC61)，BV605-anti-PD-1 (RMP1-30)；来自Life Technologies: PerCP-Cy5.5-anti-FOXP3 (FJK-16s); 来自Invitrogen pe-anti-inos (CXNFT); 以及来自Tonbo生物科学FITC-anti-CD62L (MEL-14)，APC-anti-F4/80 (BM8.1)。在lsrfortessa流式细胞仪 (bdbiosciences) 上获取流式细胞术数据，并使用flowjov.10.8.1软件 (bdbiosciences) 进行分析。scRNA-seq单细胞分离、文库制备和测序与MD安德森先进技术基因组学核心设施合作，在10x铬系统 (10x基因组学) 上进行所有样品的scrna-seq。同源来源的肿瘤K,KK和KLK当肿瘤体积达到500-700？Mm时收集LKR13小鼠模型3。在含有胶原酶a、透明质酸酶、分散酶和dna酶I的溶液中处理并解离整个肿瘤。将细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器过滤，进行RBC裂解并重悬于含有0.04% BSA的PBS中。在活力评估后，按照10x基因组单细胞铬5'v2方案，将分离的细胞进行单细胞捕获、条形码化和文库制备。合并的样品用NovaSeq6000测序仪进行测序，在MD安德森癌症中心的ATGC核心进行。Scrna-seq数据分析使用10x Genomics提供的cellranger单细胞流水线对原始scrna-seq数据进行预处理 (解复用细胞条形码，读取比对和基因计数矩阵的生成)，使用小鼠参考转录组GRCm38 (mm10)。按照先前描述的标准协议进行数据合并，过滤，去除双峰，批量效果评估和数据归一化75。使用Seurat R包 (v.4.3) 分析归一化的基因-细胞基质，并应用Harmony (v.0.1.1) 进行批效应校正。根据应用FindClusters Seurat功能鉴定的高度可变基因确定每个簇，并用singleler (v.2.2.0) 进行验证。使用具有Seurat函数RunUMAP的均匀流形近似和投影 (UMAP) 进行细胞簇的降维和二维可视化。用FindMarkers功能鉴定差异表达的基因。用AddModuleScore函数获得基因签名得分。报告摘要有关研究设计的更多信息，请访问 自然投资组合报告摘要链接到这篇文章。
数据可用性本研究中产生的数据可在文章及其补充文件中获得。本文报告的scrna-seq原始和处理数据可根据要求提供，并已以登录号存放在NCBI基因表达综合数据库 (GEO) 中GSE267321。可根据阿斯利康的数据共享政策要求提供有关临床试验结果的数据，详情请参见https://astrazenecagrouptrials.pharmacm.com/ST/Submission/Disclosure。根据通用数据保护条例 (GDPR) 标准，支持本文报告的回顾性临床数据结果的所有其他个人去识别参与者数据将可应要求提供。只有概要临床数据可以共享; 为了保护患者隐私，我们的存储库中无法访问患者级图像或遗传数据。材料、试剂或其他实验数据可根据相应作者的合理要求获得。源数据是本文提供的。
本帖最后由 行走的艺术细菌 于 2025-4-13 07:16 编辑
卡度尼利单抗简要说明书
中文名:卡度尼利单抗
英文名:cadonilimab
商品名：开坦尼
生产厂家：康方生物
规格剂量：125 mg（10mL）/瓶
价格：13220元/瓶（125mg）
2024年降价为6166元/瓶（仅供参考）
基因靶点：靶向人PD-1和CTLA-4的双特异性抗体
药品存储：于2-8℃避光保存和运输，避免剧烈晃动，请勿冷冻。
首次获批上市：2022年6月上市
仿制药：目前暂无仿制药上市
医保报销：2025年纳入医保
适应证
本品主要适用于既往接受含铂化疗治疗失败的复发或转移性宫颈癌患者的治疗。
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